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激光扫描共聚焦显微镜使用说明

作者:网站管理员 来源:本站原创 日期:2018/11/8 12:03:03 点击:10 属于:三坐标行业百科
激光扫描共聚焦显微镜使用说明

1.激光共聚焦DIC通道的光源是什么?

DIC通道的光源是激光,用的是透射光检测装置,只有透光的样品才可看到。

2.荧光和白光是反射光还是透射光?

用汞灯和激光激发发射的荧光都是反射光,卤素灯照明看到的光是透射光,不透明物体,卤素灯看不到。

3.共聚焦荧光通道的颜色是实际颜色吗?

不是,是伪彩色,光电倍增管只检测强度信息,不检测颜色信息。颜色可以随意更改。不过可通过发射波长的范围,判断大概为什么颜色。

4.彩色CCD看到的是实际颜色吗?

是实际颜色,用RGB进行了还原,但CCD颜色与目镜中看到的稍有差异。

5.激光激发肯定比汞灯激发荧光强吗?

不一定,首先激光是单色光,如488nm,而汞灯下,有一定宽度的波长范围,如470-495nm, 激发波长不一样,得到图片的效果不一样;其次,激光下采集荧光用共聚焦模式,样品层切得比较薄,而汞灯下用CCD采集图片,样品层切得比较厚。因此看弱荧光,经常是激光不如汞灯下看得更好。

6.共聚焦拍照与普通荧光显微镜拍照有什么不同?

共聚焦用激光做光源,光电倍增管做检测器,逐点扫描,对应每个像素其能量比较高;汞灯虽然总功率高,但属于场照明,对应每个像素的能量并没有激光高。共聚焦有针孔,可以排除焦平面

上焦点以外及非焦平面杂散光的影响,因此空间分辨率提高,但因为是每个像素每个像素逐点扫描,采集较慢,一张图并不是同一时间采集的,时间分辨率不高;CCD拍照取的是样品的同一时

间。

7.显微镜最重要的部件是什么?

是物镜,物镜数值孔径(N.A.)越大,其分辨率越高。普通光镜△R(分辨率)= 0.61λ/ N.A.;共聚焦△R = 0.51λ/ N.A.,λ为激发光波长。相同倍数的物镜,其N.A.值越大,荧光透过的

越多,与N.A.平方成正比;N.A.值越大,焦深越小,也就是看到的样品层越薄。

8.放大倍率怎么计算?

如果从目镜观察,观察倍率(M) = 物镜倍率 X 目镜倍率显示器观察, 视频系统(M)= (显示器对角线/CCD对角线) X 接口倍率 X 物镜倍率,共聚焦图片的放大倍率,与像素分辨率、每个像素的大小、及图像的实际大小相关。 M = 图像的实际大小/ (像素分辨率X每个像素的大小)

9. 为什么油镜比干镜分辨率高?

倒置的荧光显微镜,对干镜,激光透过物镜进入盖玻片,在物镜和盖玻片之间会有空气,激光从物镜进入空气,也就是从光密介质进入光疏介质,光会偏离法线,造成损失;对于油镜,浸油的折射率与玻璃一样,因此激光从物镜进入浸油没有光损失,因此用油镜分辨率要高。

一、观察及仪器操作
 
1.  开启仪器电源及光源

一般先开启显微镜和激光器,再启动计算机,然后启动操作软件,设置荧光样品的激发光波长,选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube,PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。
 
2.  设置相应的扫描方式
在目视模式下.调整所用物镜放大倍数,在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式,调整双孔针和激光强度参数,即可得到清晰的共聚焦图像。
 
3.  获取图像
选择合适的图像分辨率,将样品完整扫描后,保存图像结果即可。
 
4.  关闭仪器
仪器测定样品结束后,先关闭激光器部分,计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统.则应该在激光器关闭后,待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
 
二、获取三维图像 

激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能,因此,它可以在不损伤细胞的情况下,获得一系列光学切片图像。选用“Z-Stack"模式,即可实现此项功能。
 
1.  开启“Z-Stack”选项。
 
2.  确定光学切片的位置及层数。
 
3.  启动“Start”,获得三维图像。
 
三、获取时间序列图像 

共聚焦显微镜的"Time-Series"功能,可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量,开启“Start T”功能键,即可进行实验。“Time-Series"功能大大减轻了实验者的劳动强度,对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。
 

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